活性氧（ROS）检测试剂盒  

使用说明：

1. 装载ROS 探针

1.1 原位装载探针(仅适⽤于贴壁细胞)

a) 细胞准备：检测前⼀天进⾏细胞铺板，确保检测时细胞数量⼩于5×105 /ml。

b) 药 物诱导：去除细胞培养液，加⼊⽆⾎清培养基稀释的药 物处理，于37℃细胞培养箱内避光孵育，实际诱导时间由药 物特性和细胞类型决定。

c) （可选）阳性对照：先⽤⽆⾎清培养基等稀释阳性对照（Rosup, 100 mM）到常⽤⼯作浓度100 μM，加⼊细胞，37℃避光孵育0.5～4 h，以提⾼活性氧⽔平，不同细胞类型存在差异。例如：HeLa 细胞需孵育30-60 min，MRC5 ⼈胚胎成纤维细胞则需孵育90 min。

d) ROS 探针准备：探针装载前按照1:1000 ⽤⽆⾎清培养液稀释DCFH-DA，使其终浓度为10 μM。

e) ROS 探针装载：吸除处理药 物，加⼊适当体积稀释好的DCFH-DA ⼯作液。加⼊的体积需充分盖住细胞。例如：6孔板通常不少于1000 μL，对于96 孔板通常不少于100 μL。37℃细胞培养箱内避光孵育30 min。

f) 细胞清洗：⽤⽆⾎清培养液洗涤细胞1～2 次，以充分去除未进⼊细胞内的DCFH-DA。

1.2 收集细胞后装载探针(适⽤于贴壁细胞和悬浮细胞)

a) 细胞准备：按照标准⽅法培养细胞，必须保证检测⽤细胞状态。按照适当⽅法，清洗并收集⾜量的细胞。

b) 药 物诱导：将收集好的细胞悬浮于适量稀释好的药 物，于37℃细胞培养箱内避光孵育，实际诱导时间由药 物特性和细胞类型决定。

c) （可选）阳性对照：先⽤⽆⾎清培养基稀释阳性对照（Rosup, 100 mM）到常⽤⼯作浓度100 μM，加⼊细胞，37℃避光孵育0.5～4 h 以提⾼活性氧⽔平，不同细胞类型存在差异。例如：HeLa 细胞需孵育30-60 min，MRC5 ⼈胚胎成纤维细胞则需孵育90min。

d) ROS 探针准备：探针装载前，按照1:1000 ⽤⽆⾎清培养液稀释DCFH-DA，使其终浓度为10 μM。

e) 探针装载：除去细胞内药 物，离⼼收集细胞，加⼊稀释好的探针，使其细胞密度为1×106 ～ 2×107 。

注意：细胞密度需根据后续的检测体系，检测⽅法，以及检测总量来进⾏调整。例如：对于流式分析，单管检测内细胞数⽬不少于104 ，也不可多于106 。

f) 细胞清洗：⽤⽆⾎清细胞培养液洗涤细胞1-2 次，以充分去除未进⼊细胞内的DCFH-DA。

2. 荧光显微照相操作方法

a) 对贴壁⽣⻓细胞或活组织，可直接在荧光显微镜下观察；对悬浮⽣⻓细胞，取25-50 μL 细胞悬液滴到⼀张显微载玻⽚上，再盖上⼀张盖玻⽚。

b) 荧光显微镜下，选⽤FITC 滤光⽚观察荧光，去除背景观察荧光的变化。

3. 流式细胞分析操作方法

a) 对贴壁⽣⻓细胞，⽤胰酶消化制备成单细胞悬液；对悬浮⽣⻓细胞，直接收集细胞。⽤0.5-1 mL PBS 重悬细胞(0.5～1x 105 /ml)。

b) 选择流式细胞仪FL1 或BL1 通道，488nm 激发，测定530nm 的发射，细胞应可分成两个亚群：ROS 阴性细胞仅有很低的荧光强度，ROS 阳性细胞有较强的绿⾊荧光。

4.参数设置

使⽤488nm激发波⻓，525nm发射波⻓，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF的荧光光谱和FITC⾮常相似，可以⽤FITC的参数设置检测DCF。DCF的激发光谱和发射光谱参考下图。